Skrining Genom Pada Lupus Eritematosus Sistemik Manusia – Lupus eritematosus sistemik (LES) adalah penyakit autoimun yang ditandai dengan hilangnya toleransi imunologis terhadap banyak antigen diri. Data epidemiologi menunjukkan peran penting gen dalam etiologi lupus, dan penelitian genetik sebelumnya telah melibatkan lokus HLA, gen komplemen, dan reseptor IgG (Fcγ) afinitas rendah dalam patogenesis SLE. Dalam upaya untuk mengidentifikasi lokus kerentanan baru untuk SLE, kami baru-baru ini melaporkan hasil layar penanda mikrosatelit genomewide di 105 keluarga pasangan saudara SLE. Dengan menggunakan metode nonparametrik, bukti keterkaitan ditemukan dalam empat interval: 6p11-21 (dekat HLA), 16q13, 14q21-23, dan 20p12.3 (skor LOD 2.0), dan bukti yang lebih lemah di sembilan wilayah lainnya. Kami sekarang melaporkan hasil layar genom lengkap kedua dalam kohort baru dari 82 keluarga pasangan saudara SLE. Pada layar kohort 2, empat interval terbaik adalah 7p22 (skor LOD 2,87), 7q21 (skor LOD 2,40), 10p13 (skor LOD 2,24), dan 7q36 (skor LOD 2,15). Delapan interval tambahan diidentifikasi dengan skor LOD dalam kisaran 1,00-1,67. Analisis gabungan dari MN kohort 1 dan 2 (187 keluarga pasangan saudara kandung) menunjukkan bahwa penanda pada 6p11-p21 (D6S426, skor LOD 4,19) dan 16q13 (D16S415, skor LOD 3,85) memenuhi kriteria untuk hubungan yang signifikan. Tiga interval (2p15, 7q36, dan 1q42) memiliki skor LOD dalam kisaran 1,92-2,06, dan 13 interval lainnya memiliki skor LOD dalam kisaran 1,00-1,78 dalam sampel gabungan. Data ini, bersama dengan hasil pemetaan gen lain yang tersedia di SLE, mulai memungkinkan prioritas interval genomik untuk upaya penemuan gen pada SLE manusia.
Skrining Genom Pada Lupus Eritematosus Sistemik Manusia
pengantar
Lupusmn.org – Lupus eritematosus sistemik (SLE [MIM 152700]) adalah penyakit inflamasi autoimun yang dapat mempengaruhi berbagai sistem organ, termasuk kulit, persendian, otak, paru-paru, dan ginjal. Penyakit ini ditandai dengan disregulasi imun, yang menyebabkan produksi autoantibodi tingkat tinggi, deposisi kompleks imun, dan vaskulitis (Rothfield 1985). SLE paling sering muncul pada wanita (rasio F:M 9:1) pada masa subur mereka, dan perkiraan prevalensi keseluruhan di Amerika Serikat adalah 40 kasus/100.000 individu (Hochberg 1997a).
Studi epidemiologi menunjukkan komponen genetik yang kuat untuk kerentanan terhadap SLE. Studi kembar menunjukkan risiko 10 kali lipat lebih besar untuk penyakit konkordansi di MZ, dibandingkan dengan DZ, kembar (Block et al. 1975; Deapen et al. 1992), dan studi agregasi keluarga menunjukkan rasio risiko saudara kandung (λS [Risch 1990] ) minimal 10 (Vyse dan Todd 1996). Hipotesis genetik pada SLE juga didukung oleh tingginya insiden SLE pada pasien dengan defisiensi komplemen tertentu (C1q, C2, dan C4) dan hubungan penyakit dan produksi autoantibodi dengan alel HLA kelas II (Arnett 1997). Polimorfisme pada reseptor IgG (Fcγ) afinitas rendah, yang penting untuk pembersihan kompleks imun, juga terlibat dalam patogenesis lupus (Salmon et al. 1996; Wu et al. 1997).
Sebagai salah satu pendekatan untuk memahami dasar genetik untuk kerentanan terhadap SLE, sejumlah kelompok telah memulai skrining penanda genomewide pada SLE manusia (Gaffney et al. 1998; Moser et al. 1998; Shai et al. 1999). Kelompok kami di Minnesota telah berfokus pada pengumpulan keluarga saudara kandung SLE (Kearns et al. 1998), dan kami baru-baru ini melaporkan hasil dari 341-marker screen di 105 keluarga (MN cohort 1 [Gaffney et al. 1998]). Dengan menggunakan metode multipoint nonparametrik, kami mengidentifikasi 25 penanda dengan skor LOD >1,0. Enam belas penanda ini dikelompokkan menjadi empat interval berbeda: 6p11-p21 (dekat wilayah HLA), 16q13, 14q21-q23, dan 20p12. Interval ini memiliki skor LOD> 2,00, dan sembilan wilayah kromosom tambahan diidentifikasi dengan skor LOD> 1,00.
Karena tampaknya SLE, seperti banyak penyakit genetik kompleks, menunjukkan heterogenitas genetik yang signifikan, kami terus mengidentifikasi keluarga tambahan yang cocok untuk pemetaan. Di sini, kami melaporkan hasil layar penanda genomewide di 82 keluarga pasangan saudara SLE baru (kohort MN 2). Secara keseluruhan, data dari layar ini mendukung bukti keterkaitan di beberapa interval kerentanan potensial yang dilaporkan sebelumnya. Selain itu, beberapa interval baru yang hanya menunjukkan bukti lemah untuk keterkaitan dalam layar kohort 1 diidentifikasi dalam penelitian ini. Analisis gabungan dari MN kohort 1 dan 2, bersama dengan data yang mendukung dari layar lain yang diterbitkan dalam SLE, memungkinkan kita sekarang untuk memusatkan perhatian kita pada interval genomik diskrit yang kemungkinan menyimpan gen kerentanan SLE manusia.
Keluarga dan Metode
Keluarga SLE
Pengumpulan keluarga saudara-pasangan yang terkena dampak untuk penelitian ini telah dijelaskan secara rinci di tempat lain (Kearns et al. 1998). Keluarga direkrut dari semua wilayah Amerika Serikat dan Kanada, dan semua pasien memenuhi kriteria revisi 1997 untuk diagnosis SLE (Tan et al. 1982; Hochberg 1997b). Setelah informed consent diperoleh dari pasien, verifikasi diagnosis SLE dilakukan dengan meninjau catatan medis pasien dan wawancara dengan dokter pasien. Semua orang tua yang tersedia direkrut (5 terpengaruh) untuk memfasilitasi analisis pembagian alel identitas-oleh-keturunan (IBD). Jika orang tua tidak tersedia, saudara kandung yang tidak terpengaruh direkrut untuk membantu dalam rekonstruksi genotipe orang tua. Sejak laporan terbaru kami (Gaffney et al. 1998), kami telah memperoleh informasi tambahan untuk tiga dari silsilah kohort 1. Saudara perempuan yang terkena dampak dalam satu keluarga ditentukan menjadi saudara tiri berdasarkan statistik yang dihasilkan dengan menggunakan algoritma komputer RELATIF (Goring dan Ott 1997). Pada keluarga kedua, kemungkinan pasien dengan SLE yang telah dikumpulkan dan digenotipe diverifikasi sebagai pasti menderita SLE, sedangkan saudara kandung yang sebelumnya terverifikasi dengan SLE dalam keluarga yang sama ditentukan tidak memenuhi kriteria. Akhirnya, 2 sampel orang tua dari kohort 1 dikumpulkan dan dianalisis di layar kohort 2. Informasi tambahan ini mengubah skor LOD yang dihitung sedikit dalam analisis kohort 1 saat ini, dibandingkan dengan nilai yang dilaporkan sebelumnya (Gaffney et al. 1998). Semua hubungan keluarga di kedua kohort 1 dan 2 dikonfirmasi dengan menggunakan RELATIF (Goring dan Ott 1997). Studi ini telah disetujui oleh dewan peninjau subjek manusia dari University of Minnesota.
Sampel dan Genotipe
DNA genom diisolasi dari sel mononuklear darah perifer dengan menggunakan metode standar, dan genotipe keluarga dilakukan pada dasarnya seperti yang dijelaskan di tempat lain (Gaffney et al. 1998). Untuk kohort 2, perangkat pemetaan hubungan manusia berlabel fluoresensi Applied Biosystems, Inc. (ABI) (v2.0) digunakan dan dioptimalkan untuk menggandakan penanda dengan warna serupa menjadi satu atau dua koktail reaksi. PCR (32 siklus) dilakukan pada stasiun kerja robot ABI 877 Catalyst (reaksi 5 μl: 5 ng DNA genom, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs [Pharmacia], 0,2 U Amplitaq Gold DNA polymerase [PE Biosystems] dalam 1× PCR Buffer II [PE Biosystems]). Konsentrasi pasangan primer individu berada pada kisaran 0,31-3,30 pmol/reaksi, berdasarkan hasil optimasi berjalan.
Produk amplifikasi yang dikumpulkan dielektroforesis melalui gel poliakrilamida 5% (FMC Bioproducts) selama 2 jam pada 3000 V pada ABI 377 DNA Sequencer. Ukuran fragmen semi-otomatis dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak GENESCAN (v2.1; ABI), diikuti dengan pemanggilan alel dengan perangkat lunak GENOTYPER (v2.0; ABI). Setiap genotipe ditinjau secara manual oleh 2 anggota tim peneliti untuk memastikan keakuratan pemanggilan alel. Penanda yang berkinerja buruk (total 34 penanda yang didistribusikan secara acak di seluruh genom) dikeluarkan dari analisis. Tingkat dropout data keseluruhan untuk 102.000 genotipe yang dianalisis adalah 1%.
Analisis data
Analisis data dilakukan dengan GENEHUNTER PLUS (Kong dan Cox 1997), versi modifikasi dari GENEHUNTER (Kruglyak et al. 1996). Perangkat lunak ini melakukan analisis tautan nonparametrik multipoint dengan mengekstraksi informasi berbagi alel IBD di antara semua anggota keluarga yang terpengaruh di setiap lokasi dalam genom. Ini kemudian memperoleh skor hubungan nonparametrik (NPL untuk GENEHUNTER, Zlr untuk GENEHUNTER PLUS) berdasarkan jumlah individu yang terkena yang berbagi alel penanda yang sama IBD. Kami memilih fungsi penilaian Sall, untuk memungkinkan perbandingan pembagian alel IBD yang diamati di antara semua anggota keluarga yang terpengaruh (bukan hanya pasangan saudara kandung yang terpengaruh) dengan yang diharapkan berdasarkan hipotesis nol tanpa hubungan. Skor LOD dihasilkan oleh perangkat lunak GENEHUNTER PLUS dengan menggunakan persamaan LOD=Z2lr/2ln10 untuk setiap kelompok secara individual dan sebagai kumpulan gabungan. Keluarga dari berbagai kelompok etnis sama-sama diekstraksi dari file tautan utama dan dianalisis secara terpisah. Frekuensi alel yang digunakan dalam file parameter untuk setiap analisis dihasilkan dari genotipe pendiri untuk kumpulan data tersebut (kohor 1, kohor 2, kohor gabungan, kelompok etnis individu). Posisi peta penanda diperoleh dari peta rata-rata jenis kelamin terbaru yang tersedia yang disusun oleh J. Weber (Pusat Genetika Medis, Yayasan Penelitian Medis Marshfield).
Hasil
Fitur Demografis dan Klinis MN Cohort 2
Minnesota SLE kohort 2 terdiri dari 82 keluarga (75 keluarga dengan 2 saudara kandung SLE, 6 keluarga dengan 3 saudara SLE, dan 1 keluarga dengan 2 sepupu pertama yang terkena dampak; tabel 1). Dalam kohort ada 93 pasangan saudara yang terkena dampak dan 111 pasangan saudara yang terkena dampak total. Ada beberapa perbedaan komposisi famili kohort 2 dan kohort 1. Selain koleksi yang lebih kecil, kohort 2 memiliki lebih sedikit sampel orang tua atau saudara kandung yang tidak terpengaruh daripada kelompok 1. Sedangkan hanya 1 dari 105 keluarga di kohort 1 yang merupakan pasangan saudara kandung yang terisolasi (tidak ada orang tua atau saudara kandung yang tidak terpengaruh), ada 14 seperti itu. keluarga pada sampel kohort 2 sebanyak 82 keluarga. Ada juga lebih sedikit saudara kandung yang tidak terpengaruh yang tersedia dalam kelompok 2. Rasio jumlah orang tua atau saudara kandung yang tidak terpengaruh dibagi dengan jumlah keluarga adalah 1,23 untuk kelompok 2 (101/82), dibandingkan dengan 1,47 untuk kelompok 1 (155/105) . Jumlah saudara tiri keluarga sebanding antara kedua kelompok (empat di kohort 2, lima di kohort 1).
Gambaran klinis dan demografis kohort 2 disajikan pada tabel 2 dan dibandingkan dengan kohort 1. Pasien kohort 2 dengan SLE sedikit lebih tua pada saat diagnosis (34±11 vs 31±11 tahun) dan memiliki penyakit selama jangka waktu yang sedikit lebih lama (15±9 vs 12±7 tahun), dibandingkan dengan kelompok 1. Kedua kelompok terdiri dari 80% silsilah kulit putih. Dari keluarga nonkulit putih, terdapat persentase silsilah kulit hitam yang lebih tinggi dalam kohort 2. Satu-satunya perbedaan dalam gambaran klinis antara kohort adalah insiden manifestasi hematologi SLE yang sedikit lebih rendah (leukopenia, anemia hemolitik autoimun, limfopenia, dan trombositopenia) dan a persentase yang lebih tinggi dari pasien yang diobati dengan kortikosteroid, anti-malaria, dan obat sitotoksik di kohort 2, dibandingkan dengan kohort 1 (tabel 2). Tak satu pun dari perbedaan ini mencapai signifikansi statistik (P<.05).
Layar Genom MN Kohort 2
Silsilah kelompok 2 digenotipe dengan 366 penanda mikrosatelit berulang dinukleotida (panel tautan ABI, versi 2.0), pada jarak antar penanda rata-rata 8,9 cM melintasi 22 autosom. Data dikumpulkan dan analisis nonparametrik multipoint dilakukan dengan menggunakan GENEHUNTER PLUS (Kong dan Cox 1997). Ambang batas skor LOD nominal 1,0 dipilih. Dua puluh sembilan penanda positif diidentifikasi yang jatuh ke dalam 12 wilayah kromosom yang berbeda (tabel 3 dan gambar 1). Penanda dalam tiga interval memenuhi kriteria untuk hubungan sugestif (skor LOD >2.2), seperti yang didefinisikan oleh Lander dan Kruglyak (1995): 7p22 (D7S517, skor LOD 2,87), 7q21 (D7S669, skor LOD 2,40), dan 10p13 (D10S548 , skor LOD 2,24). Sembilan interval yang tersisa berisi penanda dengan skor LOD dalam kisaran 1,02-2,15 (tabel 3). Tak satu pun dari penanda dalam sampel kohort 2 yang memenuhi kriteria Lander untuk keterkaitan yang signifikan (skor LOD >3,6).
Analisis Gabungan Data Penanda dari MN Kohort 1 dan 2
Kami selanjutnya menggabungkan data penanda dari kohort 2 dan 1 untuk menentukan tingkat keseluruhan dukungan untuk hubungan dalam interval terbaik yang diidentifikasi dalam studi kohort 2 ini dan dalam studi kohort 1 sebelumnya (Gaffney et al. 1998). Penanda untuk kromosom 14-22 (total 102) identik untuk dua kelompok (panel tautan ABI v2.0). Karena kromosom 1–13 dalam kohort 1 digenotipe dengan versi sebelumnya dari panel tautan ABI (v1.0), hanya 69% dari penanda kromosom 1–13 yang sama di antara kedua kohort (181/264). Frekuensi alel untuk file parameter dihitung dengan menggabungkan data genotipe induk dari semua keluarga. Kumpulan data gabungan mewakili 230.000 genotipe dari 187 keluarga SLE, dengan total 207 pasangan saudara yang terpengaruh dan 238 pasangan relatif yang terpengaruh (tabel 1).
Hasil analisis multipoint gabungan ditunjukkan pada gambar 1 dan diringkas dalam tabel 4. Bukti keterkaitan pada 6p11-p21 dan 16q13, dua interval dengan skor LOD tertinggi dalam studi kohort 1 asli, tetap kuat dalam analisis gabungan. Pada layar kohort 2, penanda terbaik pada interval 6p11-p21 adalah D6S276 (skor LOD 1,48). Penanda ini terletak 16 cM telomer dari D6S426, penanda puncak di wilayah dari layar kohort 1 (skor LOD 4.16). Dalam analisis gabungan, bukti keterkaitan di D6S426, yang terletak hanya sentromer dari wilayah HLA di 6p, hanya menunjukkan sedikit peningkatan dibandingkan dengan hasil di kohort 1 saja, dengan skor LOD keseluruhan 4,19. Bukti keterkaitan pada 16q13 diperkuat pada penanda D16S415 ketika kedua kohort dipertimbangkan, dengan skor LOD gabungan 3,85, dibandingkan dengan skor LOD 3,47 dari keluarga kohort 1 saja. Baik interval 6p11-p21 dan 16q13 melebihi ambang batas skor LOD >3,6 yang disarankan oleh Lander dan Kruglyak (1995) untuk hubungan yang signifikan dalam sampel gabungan.